近期，意大利的耶稣聖嬰兒童醫院的Angela Di Giannatale團隊研究發現神經母細胞瘤來源外泌體攜帶miR-375，遠端轉移到骨髓創造有利的環境，從而促進骨轉移，該研究結果發表于Journal of Extracellular Vesicles 。

01  案例文章

骨髓是神經母細胞瘤（neuroblastoma ,NB）轉移的靶器官，NB侵襲骨髓的機制仍然是未知的。腫瘤微環境在腫瘤發生發展中扮演着重要作用，間充質基質細胞被認爲是腫瘤間質的組成部分。與NB患者（無骨髓轉移）相比，骨髓轉移NB患者的骨髓間充質基質細胞（BM-MSCs）展現出較強的成骨分化潛能。骨髓轉移的的NB細胞分泌的外泌體高表達miR-375，促進BM-MSCs成骨分化。臨床數據顯示，miR-375高表達與NB患者骨髓轉移相關。結果表明，外泌體miR-375在骨髓創造一個有利的微環境從而促進腫瘤轉移。miR-375作爲一個新的生物标志物，也是NB患者發生骨髓轉移的潛在靶标。

02  案例文章的研究内容

✦ NB 和 BM 轉移患者的BM-MSCs 有較強的成骨分化潛力

分别從12個NB患者（8個骨轉移，MBM-MSCs；4個無骨轉移，NMBM-MSCs）和7個健康人（HC-MSCs）分離MSCs。流式分别檢測MSCs标志物（CD90,CD105, CD81, CD9 ）和NB細胞表面标志物（GD2）均爲陽性；造血幹細胞标志物（CD34, CD45 ）和神經元标志物（CD56），爲陰性。原代分離的3組MSCs群體倍增時間無差異。成骨分化和qPCR檢測成骨分化相關因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1），MBM-MSCs 有較強的成骨分化潛能。

✦ BM轉移的NB細胞來源外泌體增強HC-MSCs的成骨分化

分别從原代腫瘤細胞（IMR-32 and IGR-NB8 cells ）和BM轉移的NB細胞（SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 ）分離外泌體。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分别與HC-MSCs共培養24h，共聚焦成像、qPCR檢測、WB檢測和成骨誘導表明，與IMR32 exo 組（原位腫瘤細胞）相比，SHSY5Y-derived exo組(骨轉移來源腫瘤細胞)MSCs内化的外泌體、骨分化相關因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1）和鈣沉積被顯著提高；

✦ miR-375在BM-metastasisNB細胞來源的外泌體和MBM-MSCs中高表達

RT-qPCR分别檢測7個NB細胞（IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 ）來源的外泌體miRNA表達。與原代腫瘤細胞來源外泌體相比，骨轉移NB細胞來源外泌體中，miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表達上調；另外，在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培養模型中，miR-375也顯著上調。

靶标預測顯示，YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潛在靶點，YAP1參與Hippo 信号通路，抑制RUNX2的活性（成骨細胞成熟必須的因子）。因此，作者推測NB分泌的外泌體攜帶miR-375到骨髓通過抑制YAP1促進成骨分化。在骨轉移來源的NB 細胞中，YAP1 的mRNA和蛋白水平顯著低于原位腫瘤細胞；不同腫瘤細胞來源的外泌體與HC-MSCs共培養，SH5YSY-derived exosomes 組YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平顯著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ，YAP1 的mRNA和蛋白表達在MBM-MSCs中也顯著降低。

✦ MiR-375調控成骨轉化因子的表達

分别構建了MiR-375過表達NMBM-MSC細胞，及MiR-375下調MBM-MSC 細胞。RT-qPCR結果表明，MiR-375過表達顯著下調YAP1的mRNA和蛋白水平，然而成骨标志物SPP1 and OSTERIX 顯著上調。相反的，抑制miR-375可以上調YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表達。

✦ MiR-375表達與NB患者的骨疾病相關 

爲了探索MiR-375與NB患者骨髓浸潤的相關性，17個HC，7個NMBM 患者和14個MBM患者的外周血來源的外泌體被收集，Q-PCR 分别檢測患者及患者血清來源的外泌體，在MBM組，MiR-375的表達上調。随後27個NMBM和33個MBM患者的骨髓樣本被收集， 突觸素（觀察NB細胞的侵襲）、miR-375 表達水平被評估；miR-375 不僅在NB細胞中表達也在成骨及骨髓的其他細胞中表達。miR-375 在NB患者的臨床相關性分析顯示，miR-375陽性與NB患者發生骨轉移正相關。在SCID小鼠模型中，PKH26 标記的外泌體可以轉移到骨髓，并且外泌體注射組miR-375表達顯著升高。

總之，本研究闡明了神經母細胞瘤通過外泌體中的miR-375，促進骨髓間充質基質細胞的成骨分化。

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