這次分享關于南京醫科大學神經外科團隊在NEURO-ONCOLOGY雜志上發表一篇題爲“EIF4A3-induced circular RNA ASAP1(circASAP1) promotes tumorigenesis and temozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling”的文章，研究發現真核起始因子eIF4A3誘導的circASAP1通過sponge miR-502-5，上調NRAS表達水平，通過MEK1/ERK1/2信号通路調節多形性膠質母細胞瘤GBM的增殖，從而促進膠質母細胞瘤的腫瘤形成。

案例文章

IF：10.247

膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，其中一半以上是膠質母細胞瘤，也稱爲多形性膠質母細胞瘤，是中樞神經系統最惡性的腫瘤。盡管經過最大限度的診斷治療後，患者存活期還是不會超過15個月。有研究表明烷基化藥物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治療多形性膠質母細胞瘤（GBM）的國際标準化療藥物。目前還發現細胞内一些非編碼RNA也能對原發性腦腫瘤起到一定的抑制作用。本研究團隊發現通過用TMZ對多形性膠質母細胞處理後，發現circular RNA ASAP1(circASAP1)高表達，進一步研究發現是EIF4A3誘導的環狀RNA ASAP1（circASAP1）是通過NRAS/MEK1/ERK1/2信号促進膠質母細胞瘤的腫瘤發生和替莫唑胺耐藥。

結果

❶ circASAP1在TMZ處理過的GBM細胞和組織中高表達

收集3對均用替莫唑胺治療過的原發性和複發性膠質母細胞瘤患者組織标本進行RNA-seq，生信分析結果表明兩組樣本中有相同的33種circRNA上調，23種circRNA下調，通過比較發現circASP1在複發性膠質母細胞瘤患者組織高表達。作者還通過培養2株耐TMZ的GBM原代細胞系和2株對TMZ不敏感的原代細胞系分析circASP1的表達量與TMZ有直接的關系，分析circASP1核酸結構設計引物，運用普通PCR和qPCR技術對耐TMZ GBM細胞中circASP1定性、定量研究，确定了在耐TMZ的GBM細胞系和組織中，circASP1表達量顯著上調。

❷ circASP1對GBM細胞增殖以及細胞耐TMZ的影響

q-PCR、CKK-8檢測法檢和克隆形成實驗測各組過表達circRNA的轉染效率，篩選出兩組過表達circRNA（sh-circASP1-2、sh-circASP1-3）作爲TUNNEL法測細胞凋亡和用WB法檢測各組細胞凋亡标志物的蛋白水平。結果表明敲低circASP1在細胞中的表達水平能抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡以及耐TMZ低下。

❸ EIF4A3促進circASP1的表達

通過circinteractome數據庫，作者發現circASP1 mRNA上遊存在四個eIF4A3結合位點；RIP實驗證明eIF4A3可以結合下遊b，c和d部分的序列，但不結合circASP1和上遊a的序列；體外構建含有eIF4A3結合位點的RNA轉錄本進行pull-down實驗，證明越多的eIF4A3結合位點，越有利eIF4A3和circASP1 mRNA的結合。通過敲低eIF4A3表達明顯抑制circASP1的表達，而過表達eIF4A3明顯促進circASP1的表達，表明了eIF4A3能結合circASP1 mRNA下遊序列，促進8和12号外顯子的環化，從而使circASP1的表達增加。

❹ miR-502-5p海綿吸附CircASAP1 

FISH分析發現，circASP1主要分布在胞漿之中，故作者猜測其在GBM中發揮作爲miRNAsponge的作用，接着利用生物信息學分析發現，隻有miR-502-5p含有circASP1的結合位點；雙熒光素酶報告基因實驗證明，miR-502-5p與circASP1存在相互結合作用；RT-qPCR和TUNNEL實驗結果發現，circASP1是通過miR-502-5p調節細胞凋亡。

❺ miR-502-5p靶向調控NRAS

結合對GBM組織的RNA-seq和pudmed上已報道的miR-502-5p靶向基因分析，挖掘到miR-502-5p的一個靶向基因是NRAS；雙熒光素酶報告基因實驗證明，miR-502-5p與NRAS存在相互結合作用；在rescue實驗中，WB結果證明circASP1通過miR-502-5p上調NRAS的表達。

❻ CircASAP1 通過NRAS/MEK1/ERK1/2 促進腫瘤增殖和TMZ耐藥

克隆形成實驗證明敲低NRAS明顯抑制GBM細胞的增殖和降低其耐TMZ性，但同時給予過表達circASP1可以逆轉該抑制效果。通過WB的方法對同時轉染過表達circASP1和給予miR-502-5p抑制劑檢測MEK1/ERK1/2信号中相關蛋白的蛋白表達水平，結果表明，circASP1的過表達促進MEK1/ERK1/2信号通路的激活對細胞的增殖以及耐TMZ性起到調控作用。作者還發現過表達circASP1的GBM細胞在小鼠體内成瘤能力明顯增強，但敲低circASP1過表達的同時給藥TMZ能抑制成瘤能力，也能夠提高小鼠的存活率。

總結

本研究說明了circASAP1在替莫唑胺耐藥中起重要作用，是預測患者預後和進行治療幹預的潛在靶點，有助于我們對GBMs發病機制的理解以及爲提供治療GBMs的技術手段提供一定的理論知識。

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